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冰冻切片操作方法与优缺点分析介绍

冰冻切片操作方法与优缺点分析介绍

发布日期:2020-04-03 作者: 点击:

组织切片伴随着显微镜技术和免疫实验等的发展而得到广泛的应用。微生物病理切片带您了解


微生物病理切片


冰冻切片操作方法与优缺点分析介绍


冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原更应 采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。


冰冻时,组织中水份易形成冰晶,往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时,影响较小,冰晶小而多时,对组织结构损害较大,在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比,而与成核率(形成速率)成反比,即冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响愈严重。因此,应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时,冰晶成核率较慢,以后逐渐增加,其临界温度为-33。C, 从-30。C降至-43。C之间,成核率急剧增加达1018,然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。


(1)速冻,使组织温度骤降,缩短从-33。C43。C的时间,减少冰晶的形成。其方法有二:


①干冰-丙酮(酒精)法:将150-200ml丙酮(酒精)装入小保温杯内,逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干冰不再昌泡时,温度可达-70℃C,用一小烧杯(50-100ml)内装异戊烷约50ml,再将烧杯缓慢置入干冰丙酮(纯酒精)饱和液内,至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织(大小为1cm×0.8cm×0.5cm)投入异戊烷内速冻30-60s后取出,或置恒冷箱内以备切片,或置-80℃低温冰箱内贮存。


②液氮法:将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时 即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。


(2)将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~3天,利用高渗吸收组织中水分,减少组织含水量。


影响冰冻切片的因素较多,因此,技术难度较大,选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类:


①恒慢冰冻切片机(Cryastat):为较理想的冰冻切片机,型号很多,但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至2-4μm,完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时,低温室内温度以-15℃~18℃为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。


②开放式冰冻切片机:包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中,温度不易控制,切片技术难度 大,在高温季节 ,切片更加困难,且切片厚8~15μm,不易连续切片,但其优点是价廉,国内有生产。


冰冻切片后如不染色,必须吹干,贮存低温冰箱内, 或进行短暂预固定后贮存冰箱保存


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